近期，西北民族大学生命科学与工程学院高丹丹教授课题组在国际食品TOP期刊Journal of Agricultural and Food Chemistry(Q1, IF = 6.2)发表题目为“Yak Casein Peptides Exhibit Antioxidant Activity via Regulating Keap1-Nrf2/ARE Pathway in H2O2-Induced HEK-293 Cells”的研究性论文。本文第一作者和通讯作者为高丹丹教授。文章聚焦牦牛酪蛋白源抗氧化肽，揭示5条牦牛酪蛋白活性肽的抗氧化功能与分子作用机制，发现这些多肽通过调控Keap1-Nrf2/ARE信号通路中抗氧化相关基因与蛋白表达，并借助分子对接证实多肽可直接结合Keap蛋白阻断二者互作。
全文链接：https://doi.org/10.1021/acs.jafc.5c14209
研究背景：
氧化应激是诱发衰老、心脑血管、神经退行性疾病的核心诱因，人体代谢产生过量活性氧自由基会持续损伤细胞、破坏机体氧化平衡。当前食品加工与临床常用人工抗氧化剂（BHT、TBHQ等）长期摄入存在潜在毒性，开发安全、易吸收的天然食源性抗氧化活性物质已成食品领域研究的热点。抗氧化小分子肽凭借安全性好、生物利用率高、来源广泛等优势，成为天然抗氧化剂最佳选择。
牦牛乳蛋白质含量高于普通牛乳，是制备生物活性肽优质原料。目前牦牛乳加工方式粗放，多制成奶粉、粗酪蛋白，深加工利用率偏低；现有乳源抗氧化肽研究多集中于牛乳、羊乳，针对牦牛酪蛋白筛选、鉴定新型抗氧化肽，并阐明其通路作用机制的报道较少。已有研究证实牦牛酪蛋白可制备降压、抗炎多肽，但抗氧化肽的分子调控机制研究存在明显空白，Keap1-Nrf2/ARE这条机体核心抗氧化信号通路在牦牛乳酪蛋白抗氧化肽中的调控规律尚不清晰，制约牦牛乳特色功能食品产业化落地。
本研究以H2O2诱导HEK-293细胞构建氧化应激模型，探究5条牦牛酪蛋白抗氧化肽（AFK、IEQI、FPFF、LPVPQ、RELEEL）的体外自由基清除能力与细胞保护作用机制，结合qPCR、蛋白免疫印迹、分子对接与动力学模拟，完整解析多肽通过竞争性结合Keap1蛋白激活Keap1-Nrf2/ARE通路的分子机理，为牦牛乳酪蛋白特色功能性产品开发、天然抗氧化配料开发提供完整理论依据与数据支撑。
结论与展望：
本研究采用H2O2诱导的HEK‑293氧化应激细胞模型，评价5种牦牛酪蛋白肽（AFK、IEQI、FPFF、LPVPQ、RELEEL）的抗氧化活性，并探究其作用机制。结果表明，5条牦牛酪蛋白肽在体外自由基清除试验中均表现出显著抗氧化能力；可显著抑制活性氧（ROS）生成，提升过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）活性，降低丙二醛（MDA）与氧化型谷胱甘肽（GSSG）水平。牦牛酪蛋白抗氧化肽对氧化损伤细胞具备良好保护作用，其作用机制为调控Nrf2、Keap1、HO‑1、NQO1的mRNA与蛋白表达，进而激活Keap1‑Nrf2信号通路。分子对接与动力学模拟进一步证实，牦牛酪蛋白肽可与Keap1蛋白稳定结合，直接干扰Keap1‑Nrf2蛋白之间的相互作用。
本研究主要借助体外细胞模型探究牦牛酪蛋白肽的活性及其抗氧化机制。尽管体外模型可为机制研究提供可控实验条件，但无法完全复刻体内复杂生理环境。但这类多肽的口服生物利用度往往受胃肠道降解、肠道吸收差等因素制约。后续研究需借助动物模型评价其体内活性、抗氧化作用机制以及口服生物利用度，推动其在食品与健康领域的实际落地应用。
图文赏析：
图1.图形摘要
图 2. 牦牛酪蛋白抗氧化肽的体外抗氧化活性。(A) 牦牛酪蛋白抗氧化肽的ABTS自由基清除能力。(B) 牦牛酪蛋白抗氧化肽的DPPH自由基清除能力。(C) 牦牛酪蛋白抗氧化肽对羟基自由基的清除能力。(D) 牦牛酪蛋白抗氧化肽对超氧阴离子自由基的清除能力。
图3.不同浓度H2O2对HEK‑293细胞的影响。(A) 不同浓度H2O2对HEK‑293细胞活力的影响。(B) 不同浓度H2O2对HEK‑293细胞形态的影响。
图 4. 牦牛酪蛋白抗氧化肽对 H 2 O 2 诱导的 HEK‑293细胞氧化应激的保护作用。(A) 牦牛酪蛋白抗氧化肽对 H 2 O 2 诱导的HEK‑293细胞氧化应激的保护作用。(B) 牦牛酪蛋白抗氧化肽保护下经H 2 O 2 氧化损伤的HEK‑293细胞的细胞形态。
图5.HEK‑293细胞中CAT、SOD的活性以及MDA、GSH、GSSG的含量。(A) 细胞内CAT的活性。(B) 细胞内SOD的活性。(C) 细胞内MDA的活性。(D) 细胞内GSH的含量。(E) 细胞内GSSG的含量。
图 6. 氧化损伤细胞内ROS的荧光强度。(A) 多维全景流式细胞仪采集的细胞内ROS荧光成像图。(B) ROS平均荧光强度数值的统计学分析。
图7.通过qPCR测定HEK‑293细胞中Nrf2 (A)、Keap1 (B)、NQO1 (C)、HO‑1 (D)的mRNA表达水平。
图8 . 采用WB分析 Nrf2 (B)、Keap1 (C)、NQO1 (D)以及HO‑1 (E)的蛋白表达水平。(A)四种蛋白的柱状图。
图9.牦牛酪蛋白抗氧化肽与Keap1的分子对接及分子动力学模拟结果分析。AFK与Keap1的分子对接（A）、AFK的RMSD值（B）、AFK的RMSF值（C）、AFK相互作用评分图（D）、AFK相互作用示意图（E）、IEQI与Keap1的分子对接（F）、IEQI的RMSD值（G）、IEQI的RMSF值（H）、IEQI相互作用评分图（I）、IEQI相互作用示意图（J）、FPFF与Keap1的分子对接（K）、FPFF的RMSD值（L）、FPFF的RMSF值（M）、FPFF相互作用评分图（N）、FPFF相互作用示意图（O）、LPVPQ与Keap1的分子对接（P）、LPVPQ的RMSD值（Q）、LPVPQ的RMSF值（R）、LPVPQ相互作用评分图（S）、LPVPQ相互作用示意图（T）、RELEEL与Keap1的分子对接（U）、RELEEL的RMSD值（V）、RELEEL的RMSF值（W）、RELEEL相互作用评分图（X）、RELEEL 相互作用示意图（Y）。
作者简介：
高丹丹，女，博士，教授，博士生导师。现任生命科学与工程学院副院长。第六批甘肃省拔尖领军人才、甘肃省教学名师、甘肃省领军人才、甘肃省陇原青年英才、甘肃省青年飞天学者、甘肃省青年教师成才奖、入选西北民族大学第一批兰山人才工程。甘肃省创新创业示范专业负责人，主要从事食源性生物活性肽、功能性食品和畜产品加工等方面的研究工作，主持国家自然基金项目2项，主持甘肃省科技厅项目8项，甘肃省青年博士基金项目2项，中央高校项目8项。科研成果荣获甘肃省科技进步三等奖2项，中国乳品工业协会技术进步二等奖，以第一作者和通讯发表高水平研究论文100多篇；主编专著4部，教材3部；授权专利27项。
